1. Функции

Больше половины энергии, расходуемой здоровым организмом, образуется за счет окисления глюкозы. Глюкоза и ее производные присутствуют в большинстве органов и тканей. Главные источники глюкозы - сахароза, крахмал, поступающие с пищей, запасы гликогена в печени, а также глюкоза, образующаяся в реакциях синтеза из аминокислот, лактата. Концентрация глюкозы в крови является производной активности процессов гликогенеза, гликогенолиза, глюконеогенеза и гликолиза. Концентрация глюкозы в крови регулируется гормонами: инсулин является основным гипогликемическим фактором, а другие гормоны - глюкагон, соматотропин (СТГ), тиреотропин (ТТГ), гормоны щитовидной железы(Т3 и Т4), кортизол и адреналин вызывают гипергликемию (контринсулярное действие). Концентрация глюкозы в артериальной крови выше, чем венозной, т.к. происходит постоянная утилизация глюкозы тканями. С мочой глюкоза в норме не выводится. Измерение глюкозы в крови является основным лабораторным тестом в диагностике диабета. Текущие критерии диагностического использования измерения глюкозы крови: сочетание клинических симптомов диабета и случайного (т.е. независимого от времени предыдущего приема пищи) обнаружения глюкозы плазмы порядка 11,1 ммоль/л и выше; обнаружение глюкозы натощак 7.0 ммоль/л и выше; уровень глюкозы в плазме через 2 часа после введения в пероральном глюкозотолерантном тесте - 11.1 ммоль/л и выше. Рекомендуется проводить контрольные исследования на наличие диабета II типа всех людей (без симптомов диабета) старше 45 лет. В более раннем возрасте скрининговое исследование проводится у людей при повышенном риске диабета (включая детей старше 10 лет). Биохимические сдвиги могут быть обнаружены за несколько лет до клинического диагноза диабета.

2. Показания к назначению анализа

• Инсулинзависимый и инсулиннезависимый сахарный диабет (диагностика и мониторинг заболевания);
• Патология щитовидной железы, надпочечников, гипофиза;
• Заболевания печени;
• Определение толерантности к глюкозе у лиц из групп риска развития сахарного диабета;
• Ожирение;
• Диабет беременных;
• Нарушенная толерантность к глюкозе.

3. Подготовка к исследованию

Натощак, не менее чем через 8 ч (!) после последнего приема пищи. Желательно брать кровь в утренние часы. Необходимо исключить повышенные психо-эмоциональные и физические нагрузки. Глюкоза во взятой пробе крови продолжает потребляться клетками крови (эритроцитами, лейкоцитами - особенно при высоком количестве лейкоцитов). Поэтому необходимо отделить плазму (сыворотку) от клеток не позже чем через 2 часа после взятия пробы или использовать пробирки с ингибиторами гликолиза. При несоблюдении этих условий могут наблюдаться ложно заниженные результаты.

• Материал для исследования:
• сыворотка или плазма крови.
• Метод определения:
• глюкозооксидазный (GOD-PAP).
• Сроки исполнения:
• 1 день.
• Единицы измерения и коэффициенты пересчета:
• Альтернативные единицы: мг/100 мл
• Перевод единиц: мг/100 мл х 0,555 ==> ммоль/л

4. Референсные значения

5. Повышение уровня глюкозы (гипергликемия):

• Сахарный диабет у взрослых и детей;
• Физиологическая гипергликемия (умеренная физическая нагрузка, сильные эмоции, стресс, курение, выброс адреналина при инъекции);
• Эндокринная патология (феохромоцитома, тиреотоксикоз, акромегалия, гигантизм, синдром Кушинга, соматостатинома);
• Заболевания поджелудочной железы (острый и хронический панкреатит, панкреатит при эпидемическом паротите, муковисцидозе, гемохроматозе, опухоли поджелудочной железы);
• Хронический заболевания печени и почек;
• Кровоизлияние в мозг, инфаркт миокарда;
• Наличие антител к инсулиновым рецепторам;
• Прием тиазидов, кофеина, эстрогенов, глюкокортикоидов.

6. Понижение уровня глюкозы (гипогликемия):

• Заболевания поджелудочной железы (гиперплазия, аденома или карцинома , бета-клеток островков Лангерганса - инсулинома, недостаточность альфа-клеток островков - дефицит глюкагона);
• Эндокринная патология (болезнь Аддисона, адреногенитальный синдром, гипопитуитаризм, гипотиреоз);
• В детском возрасте (у недоношенных, детей, рожденных от матерей с сахарным диабетом, кетотическая гипогликемия);
• Передозировка гипогликемических препаратов и инсулина;
• Тяжелые болезни печени (цирроз, гепатит, карцинома, гемохроматоз);
• Злокачественные непанкреатические опухоли: рак надпочечника, рак желудка, фибросаркома;
• Ферментопатии (гликогенозы- болезнь Гирке, галактоземия, нарушенная толерантность к фруктозе);
• Функциональные нарушения - реактивная гипогликемия (гастроэнтеростома, постгастроэктомия, вегетативные расстройства, нарушение перистальтики ЖКТ);
• Нарушения питания (длительное голодание, синдром мальабсорбции);
• Отравления мышьяком, хлороформом, салицилатами, антигистаминными препаратами, алкогольная интоксикация;
• Интенсивная физическая нагрузка, лихорадочные состояния;
• Прием анаболических стероидов, пропранолола, амфетамина.

1. Общие сведения и классификация методов

Для диагностики целого ряда заболеваний (к числу которых прежде всего следует отнести сахарный диабет, патологические состояния, связанные с недостаточностью функции печени и почек, некоторые эндокринные заболевания, новообразования мозга, поджелудочной железы и надпочечников, гиповитаминоз В1, а также ряд наследственных аферментозов) важно иметь объективное представление о состоянии углеводного обмена, кардиальным показателем которого служит содержание глюкозы в крови. Концентрация глюкозы в крови взрослого человека составляет в единицах СИ - 60-100 мг%, в международных единицах - 3,3 - 5,5 ммоль/л. В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом:

1. Редуктометрические. Практически не используются в клинике.
2. Колориметрические. Практически не используются в клинике.
3. Ферментативные:
• а) глюкозооксидазный
• - фотометрический по конечной точке
• - фотометрический кинетический
• - отражательная фотометрия - сухая химия
• - электрохимический;
• б) гексокиназный
• - фотометрический по конечной точке
• - фотометрический кинетический

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому для них опишем только принципы, недостатки и преимущества.

2. Редуктометрические методы

Редуктометрические методы основаны на свойстве сахара восстанавливать в щелочной среде соли тяжелых металлов.

К ним относятся: титрометрический метод Хагедрона и Йенсена (1923), в котором используется свойство сахаров восстанавливать при кипячении в щелочной среде железосинеродистый калий (красную кровяную соль) в железистосинеродистый калий (желтую кровяную соль). По степени этого восстановления титрометрически определяют концентрацию сахара в крови. Однако ввиду того, что в крови присутствуют ряд соединений, не относящихся к углеводам, но обладающих восстановительными свойствами (мочевая ктслота, глютатион, креатинин), п олученный результат включает всю сумму восстанавливающих соединений, содержащихся в крови, и получаемое редуктометрическими методами количество сахара в крови оказывается значительно выше истинного количества глюкозы. В этом состоит недостаток всех редуктометрических методов. Но они, тем не менее, сохраняют свое клиническое значение, поскольку разность между "кажущимся" сахаром крови и "истинной" глюкозой (так называемая остаточная редукция) у одного и того же лица есть величина постоянная, не зависящая, в частности, от введения инсулина или приема глюкозы. Однако данные методы недостаточно специфичны, неточны, а также трудоемки (из-за использования большого количества реактивов), и поэтому практически не используются в клинической лабораторной диагностике.

Ниже приводится схема реакций методом Хагедорна-Иенсена:

• белки крови + ZnSO4 → денатурация и осаждение
  
• глюкоза + К3[Fe(CN)6] → глюконовая кислота + К4[Fe(CN)6]
  
• К3[Fe(CN)6] (избыток) + KI → I2 + К4[Fe(CN)6]
  
• I2 + крахмал → синяя окраска
  
• I2 + Na2S2O3 (титрование) → Na2S4O6 + NaI (синяя окраска исчезает).

3. Колориметрические методы

Колориметрические методы, основанные на определении степени окраски соединений, образующихся в результате различных "цветных реакций":

• а) метод Сомоджи (1933), в котором используется способность глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в закись меди, превращающей, в свою очередь, арсено-молибденовую кислоту в молибденовую лазурь. Этот метод неспецифичен, трудоемок и в настоящее время редко применяется в клинико-диагностических лабораториях;
• б) метод Фолина-Ву (1919), состоящий в определении окраски молибдена синего, который образуется в результате восстановления тартрата меди в окись меди. Последняя, взаимодействуя с молибдотустенгоновой кислотой, дает цветную реакцию. Метод относительно прост: отрицательной стороной его является то, что между имеюшейся в крови глюкозой и получаемой окраской не существует строгой пропорциональности;
• в) метод Крезелиус - Зейферт (1928, 1942) основан на восстановлении пикриновой кислоты в пикраминовую с последующим ее колориметрированием. Метод быстр, но не очень точен. Ошибка может превышать 10-20%. В связи с этим указанный метод имеет ориентировочное значение;
• г) метод с антроновым реактивом по Моррису (1948) и по Роэ (1955). Антроновый метод заключается в колориметрировании цветного комплекса, образующегося в результате соединения антрона с углеводами. Точные результаты могут быть получены при наличии высокоочищенных химических реактивов и соблюдении постоянной температуры;
• д) орто-толуидиновый метод Гультмана в модификации Хиваринена - Никилла (1962), состоящий в определении интенсивности окрашивания раствора, возникающего при взаимодействии орто-толуидина с глюкозой. Этот метод специфичен и точен, дает возможность определять "истинную" глюкозу и поэтому предлагается в качестве унифицированного. Недостатки заключаются в применении неорганических (уксусная кислота) и органических (ТХУ) кислот и этапа кипячения.

Схема реакций орто-толуидинового метода:

• Белки крови + ТХУ → денатурация и осаждение
  
• глюкоза (Н+, нагрев) → оксиметилфурфурол
  
• оксиметилфурфурол + о-толуидин → сине-зеленая окраска.

4. Глюкозооксидазный метод

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента - глюкозооксидазы.

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике.

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода - супероксид анион-радикала - О2- , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

Максимум поглощения реакционной смеси - (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра КФК-2, КФК-3 или минифотометров МКМФ-02 ,МИНИЛАБ 501, так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Конечно, этот метод требует применения кинетического фотометра, однако сегодня это уже не проблема, так как во многих лабораториях имеются как импортные фотометры типа HUMALAISER (Германия), HOSPITEX (Швеция), Стат Факс и др., так и отечественные серии МИНИЛАБ.

Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением, и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной

На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод, назовем автоматические анализаторы глюкозы ЭКСАН (Латвия), БИОСЕН 5030/5040 (Германия) и отечественный полуавтоматический анализатор глюкозы АГКМ-01. Эти приборы особенно привлекательны для поликлиник, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.

Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление "сухой химии". Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Компанией "Lifescan" были созданы уникальные тест-полоски и прибор к ним, которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой "сухой химии".

Глюкометры "ONE TOUCH" предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска "ONE TOUCH" содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Тест-полоска "ONE TOUCH" имеет уникальное строение. Ее мембрана напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови "притягивается" к поверхности тест-полоски при касании.

В состав приборов "ONE TOUCH" входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор - происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: "ЖДАТЬ". Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. Когда капля полностью впитывается в мембрану, немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение в величине отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы "ONE TOUCH" откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 -ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

С момента появления на рынке приборов "ONE TOUCH" прошло огромное количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы.Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром Российской академии медицинских наук по заказу Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики РФ. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на "ONE TOUCH", сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре "ONE TOUCH" не превысил 2,5%. И это не единственное достоинство глюкометров "ONE TOUCH". В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: "приборы "ONE TOUCH" обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами "Скорой помощи", поскольку приборы эти не только надежны, но и быстро дают результаты".

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.

5. Гексокиназный метод

Гексокиназный метод также состоит из двух последовательных реакций, но совершенно других:

Реакция регистрируется при 340 нм. по образованию НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.

Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать. Методы "мокрой" биохимии обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов. Останавливаясь на диагностических наборах "жидкой" биохимии для определения глюкозы в клинической практике широко используются как глюкозооксидазный, так и гексокиназный метод. Из отечественных производителей наборов на глюкозу, отличающимися качественными характеристиками, можно выделить такие фирмы как Vital Diagnostics (C-Петербург), Вектор-Бест (Новосибирск); из зарубежных фирм - НUMAN (Германия), Лахема (Чехия).

Приборы типа BIOSEN, ESAT, АГКМ-01 требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы. Они достаточно производительны (скорость от 50 до 90 проб в час). Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий, глюкометры типа "ONE TOUCH" весьма полезны. Т.о., задача КДЛ - исходя из своих реальных возможностей, обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.

6. Литература

1. Бутолин Е.Г., Иванов В.Г. Клиническая информативность показателей биологических жидкостей организма (Справочное пособие). Ижевск, Экспертиза. 1998
2. Герасименко В.Л. Обзор методов определения глюкозы
3. Гильманов А.Ж. Клиническое значение показателей углеводного обмена.
4. Карпищенко А.И (ред) Справочник медицинские лабораторные технологии. 1-2 т. СПб, 1988.
5. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии.- Минск: Беларусь, 1982